源起研究丨免疫診斷技術原理與應用（二）
在全球范圍內，POCT、免疫診斷、生化診斷占據體外診斷市場的前三名，免疫診斷占比達24%。近年來我國免疫診斷產業發展迅速，隨著技術的不斷進步，免疫診斷取代POCT成為我國體外診斷市場規模最大的細分市場，占據31%的市場份額，免疫診斷在我國體外診斷行業中顯得更受歡迎。眾所周知，醫療行業具有較高的壁壘，因此，源起基金深度探究醫療領域，開展對免疫診斷行業研究。
免疫比濁
當抗原與抗體在特殊稀釋系統中反應而且比例合適時，形成的可溶性免疫復合物在稀釋系統中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應液出現濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應液的濁度也隨之增加。通過測定反應液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。
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圖 免疫比濁檢測原理
特點：方便、穩定、快速（10min）；適用于常規的生化分析儀，儀器成本低；要求抗體的特異性和親和力高，抗體用量較大，檢測靈敏度偏低，抗干擾能力弱。
應用：已知一定濃度范圍的抗原，如血漿蛋白：白蛋白（ALB）、轉鐵蛋白（TRF）、C-反應蛋白（CRP）、脂蛋白（a）、尿微量蛋白系列等；
發展：膠乳比濁：是將待測物質相對應的抗體包被在直徑為15－60nm的膠乳顆粒上，使抗原抗體結合物的體積增大，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高試驗的靈敏性。
2.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
圖 不同標記技術的發展歷史
將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行。將待檢樣本與固相載體表面吸附的抗體或抗原發生反應，用洗滌的方法分離未結合成分，加入酶標記的抗體（二抗），其與固相上的免疫復合物結合，經洗滌，加入酶反應底物和終止液，通過檢測體系顏色的吸光度(A)值，進行定性或定量分析。
2.3.1間接法（檢測抗體）與雙抗夾心法（檢測抗原）：
圖 間接法與夾心法檢測原理
2.3.2競爭法（檢測抗原）：
圖 競爭法檢測原理
雙抗夾心法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用，因此適用于分子量大的蛋白。而競爭法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此對小分子抗原如一些激素和藥物等的測定常用此法。
特點：1）特異性高；2）由于使用酶標記抗原/抗體，它可以催化底物分子發生反應，產生信號放大作用，而使本法具有較高的靈敏度；3）可以進行絕對定量檢測；4）檢測步驟較多，耗時長，一般需要1-2h。
應用：目前主要用于傳染病、寄生蟲病及其他方面的定量與定性診斷。
發展：生物素/親合素放大系統：
一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin），結合非常穩定，且親合素和生物素都可與蛋白、酶、熒光素等分子結合，而不影響后者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，親合素又可以偶聯多個酶標生物素，這種多級放大作用可以進一步提高檢測體系的靈敏度。
圖 生物素/親合素放大系統
2.4 化學發光免疫分析
化學發光免疫分析技術包含免疫反應和化學發光兩部分。首先將發光物質或酶標記在抗原或抗體上，抗原或抗體與待檢測物質特異性結合后，加入氧化劑或化學發光底物，經氧化或與底物產生反應后，化學發光物質會形成一個處于激發態的中間體，中間體回到基態會發射光子釋放能量。由于化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度的檢測，可以確定待測物含量。
圖 化學發光原理與分類
表：不同化學發光方法比較
特點：發光強度在4-6個量級之間，與測定物質濃度間呈線性關系。這與酶聯免疫分析的顯色法測吸光度（OD 值）0.02-2.00的線性范圍相比，優勢明顯。與熒光標記相比，不需要額外光源，儀器和試劑的成本降低。
應用：目前在大多數三級醫院，化學發光已基本取代酶聯免疫成為主流，檢測范圍涵蓋腫瘤、傳染病、甲功、激素、心標、優生優育等各個方向。
表 化學發光免疫診斷的主要檢測項目
發展：納米磁微粒化學發光（管式發光）
圖 管式化學發光檢測過程
該技術充分利用了磁性分離技術的快速易自動化性，化學發光技術的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性；新型納米材料如納米金、碳納米管、碳納米球、碳納米纖維以及量子點等聯用到CLIA中，大大提高了CLIA的信號強度和穩定性。
目前管式化學發光技術應用比較成熟，因首個樣本出結果快，支持急診插入樣本，極大地滿足了臨床檢測需求，已經在大部分定量檢測項目上對放射免疫分析技術和酶聯免疫分析技術形成替代，成為免疫診斷市場上的主流技術產品。
管式化學發光儀器與試劑需配套使用，形成封閉系統，為廠家提供了更寬的護城河。但不同廠家的檢測結果往往不具有可比性，不管是國產與進口廠家之間、進口與進口廠家之間都是如此，原因是抗原表位、干擾物質、儀器構造、試劑性能等各不相同。
2.5 免疫層析
指將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合。若用膠體金標記抗體，抗原與抗體的結合會導致膠體金積聚，因為其本身為紅色，使得該區域顯示一定深度的顏色，通過眼睛觀察就可以獲得定性的結果。使用CCD相機對顯色圖片進行灰度量化分析，可以得到相對定量（半定量）結果。
圖 免疫層析（膠體金法）原理
特點：操作簡便、快速，不需特殊儀器與其他實驗設備；
應用：早孕、心梗、傳染病、藥品、毒品等檢測。主要用于即時檢驗與居家檢驗。
發展：時間分辨熒光免疫層析
當將含有待測抗原（抗體）的樣品滴在加樣區，待測樣品中的抗原（抗體）與結合墊中的鑭系元素離子螯合物熒光納米微球標記的抗體（抗原）結合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區后，與檢測線上固定的抗體（抗原）結合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標記物繼續向前層析，與固定在質控線二抗結合。反應結束后，用紫外光源（340nm）對檢測區掃描檢測，檢測線和質控線上熒光納米微球發出高強度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質中自然發生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光（10-1000us），這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值，即可對樣品中待測物進行相對定量（半定量）檢測。
圖 時間分辨熒光免疫層析原理
圖 時間分辨熒光檢測原理
3.免疫診斷技術發展趨勢
根據我國臨床診斷市場兩極化特點，我們認為免疫診斷技術有兩個發展趨勢值得重視。
3.1大醫院檢驗科提效：高度自動化的多聯檢驗技術
代表：流式熒光技術（液相芯片）
以熒光編碼微球為核心（Luminex公司專利），集流式原理、熒光分析、高速數字信號處理等多種技術于一體，具有高通量、高靈敏度、重復性好等特點；可用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體、配體識別分析等多領域的研究。
圖 流式熒光技術原理
1）高通量：一次可同時檢測2-500種生理病理指標，這與傳統方法的逐個指標檢測相比，是質的飛躍。
2）所需樣本量少：僅需10μl,可做多個指標檢測。
3）速度快：最快9600T/h，化學發光為600T/h。
4）重復性好：可以抽取其中的100顆微球讀數，最終的數據取其均值或中位值，這樣可將誤差減到最小。
5）高敏感性和線性范圍寬，與進口化學發光相當。
6）對儀器要求高，單個項目的試劑成本低。
應用：HLA配型、自身免疫病檢測、過敏原檢測、腫瘤標志物檢測、基因突變檢測、HPV分型等眾多免疫、分子檢測。
3.2 分級診療帶來的多場景應用：小型智能化診斷技術
3.2.1 微流控芯片（固相芯片）
微流控芯片采用類似半導體的微機電加工技術在芯片上構建微流路系統，將實驗與分析過程轉載到由彼此聯系的路徑和液相小室組成的芯片結構上，加載生物樣品和反應液后，采用微機械泵。電水力泵和電滲流等方法驅動芯片中緩沖液的流動，形成微流路，于芯片上進行一種或連續多種的反應。
圖 微流控芯片原理
特點：高通量、所需樣本少；操作簡便、不需額外耗材、對儀器要求低；封閉式設計可防止對環境的污染。但其對復雜樣本分析較為困難；由于空間小，液流量小，因此檢測靈敏度和精密度相對較差。
應用：適合高濃度的多指標快速檢測，及避免污染的分子檢測領域。
3.2.2 POCT
即時檢驗（point-of-care testing），指在病人旁邊進行的臨床檢測及床邊檢測，通常不一定是臨床檢驗師來進行。根據中國醫學裝備協會POCT 裝備技術專業委員會的定義，是指采樣現場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結果的一種檢測方式。
POCT主要應用的技術包括干化學技術、免疫層析技術、免疫熒光技術、免疫比濁技術、微流控技術、生物傳感器技術，測試對象也由生化指標、免疫指標逐步外延到核酸指標。
生物傳感器：偶聯一個特定的生物檢測器（如酶、抗體或核酸探針）到一個換能器用于靶分析物的直接測定而無需從基質中分離它。商業的POCT儀器用電化學技術（如微型離子選擇電極）和光學生物傳感器去測定葡萄糖，電解質（K+、Na+、Cl-等）和血氣（PH、PCO2、PO2等）。隨著抗體固定技術和特異DNA序列的應用，生物傳感器探針將很快用于檢測激素、藥物、難于培養的細菌、病毒等。
特點：
1）儀器小型化、一體化；不需額人工處理；
2）檢測快速：30min內；
3）能夠節約綜合成本（場地、人力等）；
4）對試劑穩定性要求高、對精密度要求相對較低
5）定性與半定量檢測為主。
應用：海關、學校、戰爭、重大自然災害、重大疫情等現場應用場景；在心臟標志物、凝血、血氣、傳染病、毒品、血糖等檢測領域具有應用優勢。
4.總結
本報告主要介紹了以下免疫診斷技術的原理與應用：
1）免疫學診斷的基本概念與物質基礎：抗原、抗原決定簇、抗體、制備；抗原與抗體結合特點（特異性、可逆性、比例性）；體外診斷試劑評估指標（檢測限、檢測靈敏度、特異性）；
2）免疫診斷技術原理與應用：免疫組化（免疫熒光）、免疫比濁（膠乳比濁）、免疫層析（時間分辨熒光免疫層析）、 酶聯免疫吸附（間接法、雙抗夾心法、競爭法、生物素/親和素放大系統）、化學發光（管式發光）。
3）免疫診斷技術發展趨勢：流式熒光技術、微流控芯片技術、POCT。
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